■記者 辛雨

在包括人類在內(nèi)的高等真核生物中，有一類長度約為19~30個(gè)堿基的小RNA，在調(diào)控基因表達(dá)、抗病毒以及維持基因組穩(wěn)定性等一系列重要生理過程中起著關(guān)鍵作用。

已有研究揭示，Dicer核酸內(nèi)切酶（以下簡稱Dicer酶）是小RNA生物合成的核心分子，小RNA均為Dicer酶切割前體RNA而成。不同小RNA長度的差異主要取決于不同Dicer酶的特異性切割。

南方科技大學(xué)教授杜嘉木聯(lián)合深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部副教授李思思及美國合作者，以植物DNA甲基化通路中的Dicer酶DCL3為研究對象，首次從整體層面解析了Dicer酶識(shí)別和切割RNA的作用機(jī)制。10月15日，相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表于《科學(xué)》。

重要又神奇的酶

根據(jù)來源和功能不同，小RNA可以分為很多類，不同種類的小RNA擁有特定的長度。例如，植物中負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)基因沉默的小RNA是21-nt（核苷酸），而負(fù)責(zé)調(diào)控DNA甲基化的小RNA則是24-nt。

杜嘉木告訴《中國科學(xué)報(bào)》：“這些區(qū)別產(chǎn)生的根源在于，小RNA的生成需要一類叫作Dicer的酶去切割前體RNA，而Dicer酶同時(shí)具備‘分子尺’和‘分子刀’的功能，可以測量產(chǎn)物RNA的長度并定點(diǎn)切割前體RNA。”

值得注意的是，不同的Dicer酶可以測量并產(chǎn)生不同長度的小RNA。因此，可以說Dicer酶是小RNA生物合成的核心分子，它直接決定了所產(chǎn)生小RNA的長度、鏈特異性以及RNA的末端選擇性等關(guān)鍵特征。

Dicer酶的分子作用機(jī)制一直是小RNA領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，既往研究也獲取了其在各個(gè)狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)。然而，Dicer酶是一個(gè)動(dòng)態(tài)性非常強(qiáng)的酶。杜嘉木介紹，在催化過程中，它可以和多種輔助因子結(jié)合，完成抓取前體RNA、將RNA放置到活性位點(diǎn)，并開展定點(diǎn)切割等一系列動(dòng)態(tài)過程。

此外，既往研究沒有觀測到切割狀態(tài)下的Dicer酶是如何從一側(cè)抓取RNA的末端，并利用自身作為“分子尺”量取特定長度，隨后在RNA另一側(cè)定點(diǎn)切割的。

杜嘉木指出，此前Dicer酶切割機(jī)制的研究已積累了很多生化數(shù)據(jù)，為本研究做了重要鋪墊。例如，發(fā)現(xiàn)Dicer酶家族成員DCL3作用機(jī)制需要其前體RNA的先導(dǎo)鏈5’端第一個(gè)堿基是磷酸化的A，互補(bǔ)鏈3’端需要有1-nt的末端突出，DLC3可以量取24-nt的小RNA等。

無心插柳：抓到Dicer酶活性狀態(tài)

在植物中，DNA甲基化的從頭建立需要一個(gè)植物特有的信號(hào)系統(tǒng)——RNA指導(dǎo)的DNA甲基化。這個(gè)系統(tǒng)中采用了長度為24-nt的小RNA作為信號(hào)來介導(dǎo)DNA甲基化。

“植物利用DCL3特異性生成24-nt的小RNA來介導(dǎo)DNA甲基化。”杜嘉木強(qiáng)調(diào)，雖然這個(gè)通路在動(dòng)物體內(nèi)并不存在，但是動(dòng)植物在基于Dicer酶的小RNA生成方面的生化機(jī)制相同。

研究人員在研究植物DNA甲基化時(shí)，非常幸運(yùn)地抓到了DCL3的活性狀態(tài)。

“我們發(fā)現(xiàn)DCL3幾乎沒有結(jié)合因子，而其自身的酶活性非常高，非常適合作為模型系統(tǒng)來研究Dicer酶的測量和切割機(jī)制。”杜嘉木說。

為此，研究人員在反應(yīng)體系中加了鈣離子，利用鈣離子模擬鎂離子催化抑制切割的作用，使DCL3處于結(jié)合RNA的狀態(tài)又因離子不同無法繼續(xù)切割，從而卡在切割前的活性狀態(tài)。

“結(jié)果正如我們所預(yù)測，實(shí)驗(yàn)中DCL3-RNA復(fù)合物恰好處在Dicer酶的活性切割狀態(tài)，從而成功解析了DCL3識(shí)別和切割RNA的機(jī)制。”杜嘉木說，“我們觀測到DCL3需要將前體RNA的第一個(gè)堿基對打開，從而使前導(dǎo)鏈和互補(bǔ)鏈的5’磷酸和3’末端突出，分別插入到Dicer酶的兩個(gè)相鄰的結(jié)合口袋，產(chǎn)生特異性識(shí)別。”

李思思補(bǔ)充說，基于RNA結(jié)構(gòu)的生化性質(zhì)測定發(fā)現(xiàn)，DCL3對5’起始的測量更加敏感，而對3’起始的測量具備較高的容錯(cuò)性。“為了證明這個(gè)推論，我們設(shè)計(jì)出不同的RNA并開展酶活實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了Dicer酶更依賴于5’起始測量RNA的機(jī)制，證實(shí)了基于結(jié)構(gòu)的推論。”

在切割層面，該研究還首次觀測到了RNA處在Dicer酶的活性中心的構(gòu)象，觀測到了活性狀態(tài)Dicer酶扭曲RNA，并對RNA的前導(dǎo)鏈和互補(bǔ)鏈相差2-nt同時(shí)切割的狀態(tài)，解釋了體內(nèi)DCL3產(chǎn)物總是一條24-nt、另一條23-nt的原因。

“因?yàn)镈CL3下游的AGO4蛋白只識(shí)別24-nt的RNA，因此該結(jié)果也解釋了前期觀測到的、RNA指導(dǎo)的DNA甲基化中小RNA的不對稱性產(chǎn)生現(xiàn)象。”杜嘉木說。

人造Dicer酶或許“觸手可及”

Dicer酶的作用機(jī)制是小RNA合成的核心。該研究在解析植物DCL3作用機(jī)制的過程中，也大量借鑒了動(dòng)物Dicer酶研究的成果，從另一個(gè)側(cè)面展示出Dicer酶家族在機(jī)制層面具有相當(dāng)強(qiáng)的保守性。

李思思向《中國科學(xué)報(bào)》表示，小RNA是未來潛在的疾病治療手段，很多基于小RNA的治療策略正在研發(fā)當(dāng)中。

“人的Dicer酶與很多疾病相關(guān)，也是目前基于RNA干擾療法的核心。”杜嘉木表示，該研究不僅解析了植物DCL3特異性產(chǎn)生24-nt小RNA的機(jī)制，也在很大程度上對動(dòng)物Dicer酶特別是人Dicer酶的作用機(jī)制有提示作用，這對未來RNA干擾療法的發(fā)展及設(shè)計(jì)都有重要意義。

基于該研究揭示的Dicer-RNA互作機(jī)制，還使得人為設(shè)計(jì)Dicer-RNA成為可能。“這樣，就可以在不影響體內(nèi)Dicer酶正常工作的情況下，選擇性切割特定RNA，這為未來Dicer酶的應(yīng)用研究提供了一個(gè)新窗口和新思路。”李思思說。

杜嘉木介紹，下一步，課題組將繼續(xù)設(shè)計(jì)不同的RNA，力求獲取DCL3抓到RNA及將RNA放到活性位點(diǎn)前的狀態(tài)，完整解析Dicer酶的作用機(jī)制。