近期，中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心（神經科學研究所）、上海腦科學與類腦研究中心、神經科學國家重點實驗室研究員劉志勇課題組在Development上，在線發表題為《嵌合CRISPR-stop技術實現核心基因突變的快速表型分析》的研究成果。
小鼠和人類的聽覺系統在發育及功能上較相似，因此，利用小鼠模型篩查耳蝸聽覺毛細胞發育過程中的重要基因對毛細胞再生和臨床上尋找耳聾基因的治療靶點具有重要意義。盡管耳蝸毛細胞在幼年和成年不同發育時期的轉錄組分析已有報道，但目前，學界對毛細胞分化成熟的分子機制仍知之甚少，其中的一個主要原因是傳統的小鼠模型構建費時費力，通常需要先構建F0代小鼠，然后進行生殖細胞傳代，獲得遺傳穩定的F1小鼠之后再進行后續的實驗。
為了快速進行突變基因的表型篩查，劉志勇課題組在2018年建立了直接在F0代小鼠中同時敲除三個非致死基因的方法，但小鼠約25%的基因純合突變會導致早期胚胎流產或出生后致死，這導致之前的策略并不適合致死基因的突變篩查。解決該問題的常規策略是利用Cre/Loxp系統進行條件性基因突變，但該策略更費時費力。
如何加速致死基因的表型分析呢？該研究中，研究人員首次嘗試在小鼠2細胞期卵裂球的1個細胞內注射單堿基編輯元件和基因特異性的sgRNA，產生嵌合體突變的小鼠，即在該小鼠的各個器官內，野生型（沒有基因編輯的細胞后代）和純合突變型（經過基因編輯的細胞后代）的細胞交錯分布，因此，該方法被命名為MosaicCRISPR-stop。
研究人員利用Atoh1基因來檢測方法的可行性。Atoh1 -/-小鼠不能產生耳蝸毛細胞且出生后由于呼吸節律紊亂而致死，結果顯示，利用Mosaic CRISPR-stop方法產生的Atoh1突變小鼠的耳蝸毛細胞數量顯著減少且該小鼠可存活到成年。隨后，致死基因Sox10突變耳蝸長度縮短的表型也可被Mosaic CRISPR-stop方法重現。最后，研究人員利用該方法，探索了Rbm24基因（其突變導致心臟異常和胚胎期死亡）的功能。Rbm24在耳蝸毛細胞高峰度表達，但其功能尚未知。利用Mosaic CRISPR-stop方法，研究人員在8周內快速鑒定出Rbm24 -/-嵌合小鼠耳蝸的表型為毛細胞大量死亡，這表明Rbm24對毛細胞的存活起重要作用，該表型也可被傳統的Rbm24條件性敲除小鼠模型所重復。
Mosaic CRISPR-stop研究方法不僅適用于聽覺系統，也適用于其他器官組織，具有普適性，可加速發育神經生物學領域鑒定基因功能的速度。該研究由劉志勇指導，主要由腦智卓越中心博士研究生王廣琴和博士后李超完成，劉志勇課題組的賀順姬對研究工作做出了貢獻。研究工作得到中科院、科學技術部、國家自然科學基金委的支持。
圖1.利用Atoh1驗證嵌合型突變方法的可靠性。（A）雙報告基因小鼠的模式圖。沒有cre表達時，所有細胞表達紅色蛋白；有cre表達時，細胞關閉紅色，開始表達綠色蛋白。（B）二細胞期受精卵的一個細胞注射cre，內生細胞團（inner cell mass，ICM）和耳蝸（cochlea）同時含有綠色和紅色的細胞。（C）Atoh1基因兩個高效的sgRNA（1+3）的位置示意圖。（D）在二細胞期受精卵的一個細胞內注射cre，單堿基編輯系統（BE3）和 2個針對Atoh1基因的sgRNA（1+3），直接產生的F0小鼠是嵌合型純合突變，可用于快速的表型分析。（E-F）相對于對照組（E），嵌合型純合突變小鼠耳蝸的毛細胞數量顯著減少。
圖2.利用嵌合型突變方法快速鑒定出Rbm24是維持耳蝸外毛細胞存活的重要基因之一。（A）二細胞期受精卵的其中一個細胞注射更新版本的單堿基編輯系統（hA3A-BE3）和Rbm24特異的sgRNA-1，直接產生的嵌合型純合突變F0小鼠可以立即用于表型分析。（B-C’）相對于對照組（B 和B’），嵌合型純合突變耳蝸（C和C’）的外毛細胞大量死亡。白色箭頭所示是殘留的、依然表達Rbm24的外毛細胞（Prestin+）。（D）跟注射LacZ sgRNA（藍色）的對照組相比，實驗組（紅色）的外毛細胞數量顯著降低。
免責聲明：市場有風險，選擇需謹慎！此文僅供參考，不作買賣依據。
