除了基因敲除、堿基編輯，提升基因功能是否還有其他的全新路徑？中國農業大學植物保護學院姜臨建與青島清原化合物有限公司李華榮、中科院分子植物科學卓越創新中心朱健康、貴州大學宋寶安等研究人員開展合作，報道了一種“基因敲高”的新策略。11月15日，相關論文發表于《自然—植物》。
研究人員表示，這項研究進一步深化了對基因編輯工具的認知和理解。基因編輯創制基因組結構變異是以自然為師。“基因敲高”有望成為基因編輯技術在動植物育種上應用的新領域。
第三大應用場景
以CRISPR/Cas9為代表的基因編輯技術能夠在基因組上產生精準突變，為動植物育種提供了革命性工具。由于基因編輯的最終產品不含外源基因，并且也可以通過傳統誘變或自然突變獲得，因此基因編輯作物在很多國家被視為普通品種。在美國上市的高油酸大豆、在日本上市的高γ—氨基丁酸番茄等，都是基因編輯產品作為常規品種推廣的案例。
論文通訊作者姜臨建介紹，目前，通過基因編輯技術來精準誘變基因的應用主要集中在兩個場景：一是對基因敲除，這是目前基因編輯在育種方面最普遍的應用。上述大豆和番茄就是基因敲除的兩個例子。二是對基因進行點突變，即通過堿基編輯提升基因功能。已在美國推廣種植的抗ALS除草劑油菜就是通過堿基替換，使內源ALS基因獲得了抗除草劑的新功能。隨著堿基編輯技術的快速發展，該領域的應用正日益深入。
“鑒于大量的基因通過提升其表達量即可帶來性狀的改良，因此基因敲高（即上調基因表達）是與基因敲除、堿基編輯提升基因功能并列的第三大應用場景。”姜臨建說。
上調基因表達的通用技術路線是在目標基因附近插入調控元件，例如強啟動子、增強子等，從而提高目標基因的表達水平。但是，由于插入整合了人工DNA，在推廣應用方面可能會面臨嚴格的監管。很顯然，如果能夠在不插入人工DNA的前提下實現上調基因表達，將在推廣應用方面更具優勢。不過，傳統觀點認為該技術路線很難實現。
“敲高”水稻內源基因
由于轉基因過表達水稻PPO1和HPPD就能夠分別帶來對兩種專利除草劑（中國自主知識產權）的抗性，該研究的核心問題是，如何在不整合人工合成DNA（作為強啟動子）的前提下，利用基因編輯技術大幅“敲高”這兩個基因的表達。
許多研究很早就發現，Cas9同時在一個基因的不同位置切割時，會造成刪除、倒位、重復等基因組結構變異。研究團隊突然意識到，只要在所要上調表達的目標基因附近找到高表達基因并選擇恰當的位點切割，就能夠創造出特定的結構變異，將高表達基因的啟動子與目標基因相連接，形成新的基因表達模式，從而大幅“敲高”目標基因的表達。
據此，研究團隊根據水稻轉錄組信息，分別在PPO1和HPPD附近找到了高表達基因CP12和Ubiquitin2，并采用相關設計，構建了雙靶點CRISPR載體對水稻愈傷進行了大規模轉化，成功在水稻植株中創制了兩種不同且可以穩定遺傳的基因組結構變異。
在被成功編輯的水稻植株中，CP12基因的啟動子驅動PPO1基因的表達，Ubiquitin2基因的啟動子驅動HPPD基因的表達，從而大幅“敲高”了水稻內源PPO1和HPPD基因，使水稻植株表現出預期的抗除草劑性狀。
作者表示，抗除草劑品種配合高效的專利除草劑，有望為水稻田雜草防控提供更加高效的解決方案。
有望成為基因編輯技術新領域
長期以來，Cas9一直被作為基因敲除工具，而點突變及上調基因表達通常需要插入人工DNA模板，這是對基因編輯工具的傳統認知。
之前，該團隊開發了“循環打靶”堿基編輯策略，通過雙靶點的“循環打靶”設計將Cas9變成了全功能的堿基編輯器。此次研究中，團隊設計了能夠上調基因表達的倒位、重復等基因組結構變異，成功實現了對目標基因的敲高。
姜臨建表示，這意味著無需人工DNA模板，Cas9不僅能夠敲除基因，還可以創制點突變和敲高基因，是名副其實的全功能基因及基因組編輯工具。該研究進一步深化了對基因編輯工具的認知和理解。
隨著長片段測序技術的發展，在基因組層面上比較不同品種之間的差異成為可能，“泛基因組學”方興未艾。大量泛基因組學研究表明不同品種之間存在大量結構變異。一些重要的農藝性狀就是基因組結構變異的結果。例如，蟠桃和圓桃之間的果型差異是由桃基因組上大片段的倒位導致的；水稻基因組上特定片段的重復能夠影響秈粳雜交稻的育性。
由此，作者認為，基因組結構變異是物種演化的重要推動力，是自然界中的普遍現象。通過基因編輯技術創制預期的結構變異，是以自然為師而已。
改變基因的表達模式是動植物遺傳改良的重要方面，但長期以來主要依靠插入人工DNA來實現。這項研究提供了改變基因表達模式（尤其是敲高基因）的通用方法，不需要插入人工DNA，有望開辟基因編輯技術在動植物育種上應用的新領域。（記者 王方 通訊員 何志勇）
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